Thema der Diplomarbeit:

Erarbeitung eines modularen Konzepts für die Allergenanalytik

Zusammenfassung

  Im Rahmen der Allergenanalytik wurden am Beispiel Erdnuss neben ELISA- Tests ausgewählte Real- Time PCR- Verfahren evaluiert und verschiedenen Optimierungsstrategien unterzogen, da mit molekularbiologischen Ansätzen bislang noch nicht die Sensitivität immunologischer Verfahren erreicht werden konnte.

Durch eine Verbesserung der DNA-Isolierung in Kombination mit effizienten Reinigungsschritten konnte bei der Aufarbeitung von DNA aus unterschiedlichen Matrices eine Steigerung der DNA-Qualität erreicht werden. Dies ermöglichte eine deutliche Erhöhung der Sensitivität in der anschließenden PCR. Durch den Einsatz geeigneter PCR-Systeme in Kombination mit DNA-Aufarbeitungen hoher Qualität konnte gezeigt werden, dass der Nachweis von allergenen Spuren im unteren ppm- Bereich (2ppm) nicht nur durch ELISA’s, sondern auch mittels Real- Time PCR erbracht werden kann.

Der Vergleich von PCR- und ELISA- Ergebnissen an unterschiedlichen Matrices mit Erdnussgehalten im unteren Nachweisbereich zeigt eine absolut vergleichbare Sensitivität. Durch die Verwendung hochgereinigter DNA ist damit eine Absicherung von positiven ELISA- Ergebnissen möglich, selbst wenn es sich um den Nachweis von Spuren an der Detektionsgrenze handelt.

Erste erfolgreiche, hausinterne Versuche zur Übertragbarkeit auf weitere Real- Time PCR Nachweissysteme für andere Allergene, weisen auf die Bedeutung der erzielten Ergebnisse hin.

Summary

The detection of allergens in food is of great importance for the allergic persons because allergic reactions can be triggered by very small amounts of an allergen (sometimes less than one milligram). Especially peanuts are the most common cause of food allergy. They can cause severe anaphylactic and potentially fatal reactions in sensitive persons.

Allergen testing methods play an important part in the validation and ongoing verification of Allergen Control and need therefore careful consideration. Currently available Allergen testing methods are Immunoassay-based laboratory kits, mostly using Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) techniques and DNA detection methods based on Polymerase Chain Reaction (PCR).

In order to gain highly reliable and sensitive detection methods several ELISA-Kits and real-time PCR Methods have been subjected to a cross-validation. PCR-Methods were further optimized to obtain higher sensitivity. An increase of the sensitivity of the PCR could be reached by optimization of the DNA-extraction in order to receive DNA of high quality. The combination of an optimized DNA-extraction and DNA-purification produced results similar to those of the ELISA-systems (2ppm). Even in chocolate and cookies, that are known to be difficult matrices, traces of peanut could still be detected. Selection of suitable PCR-Systems as well as an appropriate DNA-isolation procedure was shown to be of particular importance for the applicability.

Further analyses of hazelnut traces in chocolate imply the usefulness of such sensitive real-time PCR systems. Additional applications appear to be feasible in the detection of trace amounts of various allergens.